D
A、实验中用无菌棉棒的目的是为了防止棉棒上的微生物污染培养基，接种是将少量细菌或真菌放在培养基上的过程．该选项的说法是正确的．
B、因为经高温灭菌处理后，可以将培养皿上、培养基内混有的细菌或真菌的孢子等杀死，这样就排除了实验外其他环境的污染．该选项的说法是正确的．
C、细菌和真菌几乎无处不在，但在不同环境中分布的多少不同，如洗手前培养基上菌落的数量较多，洗手后培养基上菌落的数量较少．该选项的说法是正确的．
D、接种以后再灭菌会把接种的微生物杀死，导致实验失败．该选项的说法是不正确的．
故选：D．
